细胞凋亡实验步骤及需注意

一、检验目的

1、掌屋增殖蛋白的形态基本特征 2、学会用萤光和探针对蛋白顺利进行双标识来探测正常活着蛋白、增殖蛋白和病变蛋白的方法

二、检验原理

蛋白死亡根据其连续性、起源及生一物学意义区分为增殖和病变两种不尽相同类型。增殖普遍长期存在于生命界，在生一物个微和肉食动一物里起着更加重要的效用。它是蛋白在一定生理突起况下一系列顺序引发事件的重新组合，是蛋白遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。蛋白增殖具有可筛选的哺乳类和化学基本特征。

在形态上可见增殖蛋白与周围蛋白转回接触，蛋白变园，蛋白膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、蛋白核固缩软化呈圆形团块突起或新月突起分布、内质网和蛋白膜更进一步融合将蛋白分成多个完整包裹的增殖小微，增殖小微仍要被狂暴蛋白狂暴消化。在增殖过程里蛋白概要一物并不释放到蛋白之外，不会影响其它蛋白，因而不导致炎症加成。

在化学上，多数蛋白增殖的过程里，内源性核酸内切酶活着化，活着性增加。核DNA随机地在核小微的通往部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种；也。如果对核DNA顺利进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯突起带纹）的基本特征。

相比之下，病变是蛋白处于震荡挫伤突起况下引发的蛋白死亡。蛋白在病变早期即失去质膜完整性，各种蛋白器加速，进而质膜崩解释放出其里的概要一物，导致炎症加成，病变过程里蛋白核DNA虽也降解，但由于长期存在各种长度不等的DNA；也，只能产生梯突起带纹，而呈圆形低质量突起。

一些温和的挫伤性刺激及一些防类固醇可归因于蛋白增殖，上会这些因素在归因于增殖的同时，也可产生蛋白病变，这收决于挫伤的震荡持续性和蛋白本身对性刺激的敏感持续性。

棱果酰胺硫（HT）是必将自行研制的一种对急性粒蛋白脑癌，急性单核脑癌等有良好的防类固醇。研究工作表明HT在0.02~5μg/ml在世界上效用2小时，即可归因于HL-60蛋白增殖，并平庸出类似的增殖基本特征。本检验用1μg/ml HT在微之外归因于培养的HL-60蛋白引发增殖，同时也有少数蛋白引发病变。用Hoechst33342和甲酸丙啶（propidium iodide，PI）对蛋白顺利进行双重染色剂，可以区别增殖、病变及正常蛋白。

蛋白膜是一丝氨酸的生一物膜，一般的生一物染料如PI等只能穿过质膜。当蛋白病变时，质膜不完整，PI就重回蛋白在表面上，它可插入到DNA或RNA里，使病变蛋白着色，增殖蛋白和活着蛋白不着色。而一些活着蛋白染料由于为亲脂性一物质，可跨膜重回活着蛋白，因而可顺利进行活着蛋白染色剂。Hoechst33342是一种活着性萤光和染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种酰胺。与DNA特异紧密结合（主要紧密结合于A-T）硫基区），显示增殖蛋白和活着蛋白。凡是看到有增殖小微的蛋白都是增殖蛋白。

三、检验用品

1、试剂：棱果酰胺硫（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、硫性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%苯酚；溴酚蓝，蔗糖氰化。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 2、图书资料：萤光和孔径，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。

四、检验材料

人早幼粒脑癌HL-60蛋白，用含10%杜兰特血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2突起况下培养。

五、方法步骤

1、棱果酰胺硫归因于HL-60蛋白增殖 （1）检验前约24小时，接种两玻璃瓶HL-60蛋白，标识①、②，每玻璃瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。 （2）检验前约2.5小时，当蛋白量达到70%，①号玻璃瓶转为棱果酰胺硫200μl，使终浓度为1μg/ml，②号玻璃瓶里转为同等量PBS（pH7.4）作对照。共同抽出培养箱里再次培养2.5小时。

2、Ho33342和PI双重染色剂筛选三种蛋白 （1）染色剂：将玻璃瓶里的蛋白摇匀收200μl于1.5ml的离心管里，转为Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色剂15分钟。 （2）滴片：收一载玻片用双面胶排列成一四人，从离心管里各收以上染色剂后的蛋白悬液10μl，转为四人内盖上盖玻片，萤光和镜下用紫之外聚焦光和，高倍镜下观察，区别三种蛋白，并警惕三者分之一。

六、警惕事项

1、归因于培养HL-60蛋白时间要正确； 2、萤光和孔径下观察蛋白时，由于萤光和易碎兴兵，观察时要尽量快。